羽绒羽毛 粪链球菌检测标准研究

　　摘要：

　　本文对羽绒羽毛微生物中粪链球菌的特性、检测标准以及检测方法进行了综述，分析了各标准及方法的差异，提出了现代微生物检测技术在粪链球菌检测中应用的发展方向。

　　关键词：羽绒羽毛微生物；粪链球菌；检测方法；确证试验

　　1前言

　　羽绒羽毛及其制品具有轻、柔、暖、抗潮等优良特性，备受广大消费者青睐，具有其他产品不可替代的优势。随着国家改革开放和市场经济的持续稳定发展，我国羽绒羽毛及其制品的进出口规模也在不断扩大。与此同时，国内外消费者对羽绒羽毛及其制品的要求不仅仅是美观舒适，而且更注重衣服的安全性、卫生性和环保性。特别是2004—2005年全球范围内禽流感疫情的发生，使羽绒羽毛及其制品作为动物源性产品，其微生物指标成为消费者关注的问题之一[1]。

　　目前国内外关于羽绒羽毛微生物检测标准有FZ/T 80001—2002《水洗羽毛羽绒试验方法》[2]、GB/T 10288—2003《羽绒羽毛检验方法》[3]、SN/T 0475—95《出口商品中粪链球菌群检验方法》[4]和EN 1884—1999《羽绒羽毛微生物状态测定方法》[5]等。涉及的羽绒羽毛微生物检测指标包括嗜温性需氧菌、粪链球菌、还原亚硫酸梭状芽孢杆菌、沙门氏菌等。粪链球菌作为其中一项重要检测指标，是引起产品不合格的主要污染菌。粪链球菌为条件致病菌，比沙门氏菌、致病性大肠杆菌抵抗性及存活率均高，能够通过羽绒羽毛及其制品感染人类。因此，粪链球菌的检测具有重要意义，可以直接或间接地表明送检样品的卫生状况以及受污染程度，并判断出该样品在使用上是否安全[6]。

　　2粪链球菌特性

　　粪链球菌(又名粪肠球菌)含链球菌D群抗原，属于D群。种系分类法证实D群链球菌的肠球菌与链球菌同源程度低，Schleifer等于1984年将其命名为肠球菌属[7]。粪链球菌生物学特性为革兰氏阳性球菌，呈单个、成对或短链状排列，琼脂平板上生长的细菌呈球杆状，液体培养基中呈卵圆形、链状排列，无芽孢和荚膜，个别菌种有稀疏鞭毛。其培养特性为兼性厌氧，最适生长温度35℃，多数菌株在10℃和45℃均能生长，营养要求不高。所有菌株在含6.5%NaCl肉汤中能生长，在40%胆汁培养基中能分解七叶苷，不含细胞色素氧化酶和触酶。DNA的4种碱基中，鸟嘌呤和胞嘧啶(DNA GC)所占的比例为37%～45%[8]。粪链球菌所致感染最多见于泌尿道感染，是重要的医院感染病原菌。粪链球菌引起的菌血症常发生于有严重基础疾患的老年人、长期住院接受抗菌药物治疗的免疫功能低下患者[9]。不同来源的粪链球菌在致病性方面具有许多相似之处。动物源性产品很有可能会成为人肠球菌感染的一个新途径[10]。

　　3粪链球菌检测方法比较

　　3.1粪链球菌检测方法

　　目前，检测粪链球菌的方法有4种，分别是涂布法、滤膜法、多管法和平板法。对粪链球菌的确证试验有显微镜检查、生化检验以及血清试验3种。各标准中的具体检测方法及参数如表1所示。

　　3.2粪链球菌检测方法分析各标准检测方法的不同主要有以下两个方面：

　　(1)标准培养方法不同。FZ/T 80001—2002、GB/T 10288—2003和EN 1884—1999标准中细菌培养使用涂布法，该方法适用于细菌含量较高的样品，特点是简单、快速，可以对微生物进行分离并观察菌落特征。但在实际运用中，涂布法的接种量过少，当遇到细菌含量较低的样品时，易因检出率低，引起假阴性结果，从而误导检测人员产生错误判定。GB/T 10288—2003、EN 1884—1999以及SN/T 0475—95标准中都提及运用滤膜法，该方法对样液进行抽滤，以将样品中少量的细菌浓缩集中，适用于检测细菌含量较低的样品，特点是操作简单、快速、准确度高。在遇到样品中细菌含量较少，涂布法检出率低的情况下，应采用滤膜法进行检测，以防止漏检。此外，SN/T0475—95标准中还提到多管法和平板法。多管法适用于细菌量较少的样品检测，对检测人员的专业判别能力具有一定的要求，缺点则是成本较高，操作繁琐。平板计数法运用于细菌量较大的样品检测，缺点是此类检测稀释梯度不够明确，不能确保单个菌落形成，不易计数。当采用涂布法或滤膜法对样品进行培养，且细菌含量过高超过有效值时，应当改用平板计数法进行。反之细菌含量过少低于有效值时，应当改用多管法对其进行培养。综上所述，目前关于羽绒羽毛粪链球菌的检测标准较多，检测方法不统一，使得检验结果的差异较大。同种样品因使用不同的检测方法，其检测结果完全不同。检验人员应结合现行标准中的4种培养方法，根据样品中细菌含量的多少，针对性地选择合适的检测方法，以确保检验结果的科学性和准确性。

　　(2)标准确证试验方法不同。标准FZ/T 80001—2002、GB/T 10288—2003和EN 1884—1999中确证试验使用显微镜镜检技术，该方法是用来观察微生物的形态，以鉴别粪链球菌属革兰氏阳性球菌。现行大部分标准对于粪链球菌镜检方面描述模糊，仅GB/T 10288—2003明确提出镜检菌属为革兰氏染色阳性球菌，标准中镜检方法的不确定，必然会导致结果出入。同时，显微镜镜检技术是一种必不可少的初步筛查试验，可以为下一步的生化和血清学试验做铺垫。如镜检结果为阴性则无需进行进一步试验，反之则需进一步筛查。现行标准FZ/T 80001—2002、GB/T10288—2003、EN 1884—1999和SN/T 0475—95中仅提到粪链球菌D群的血清和生化学鉴定，无具体的试验描述。而生化试验用于鉴别细菌，尤其对形态、革兰氏染色反应和培养特性相同或相似的细菌较为有效。血清学试验是根据细菌的抗原、抗体具有高度特异性的原理来进行试验，用来鉴定分离到的细菌菌属，达到最终确认检测结果的目的。这4个标准中对于生化试验和D群血清试验描述的缺失使该确证方法不统一，缺乏可操作性，易导致检验人员遗漏部分关键性试验，且国内无商品化诊断血清，需专门从国外采购，采购周期长，保存时间短，所以国内相关实验室基本不采用该项验证试验。

　　4羽绒羽毛粪链球菌检测技术的发展趋势

　　羽绒羽毛微生物检测有别于其他产品检测，它对检测人员知识的全面性具有更高的要求，任何方面知识的欠缺都可能使监测数据的真实性和准确性大打折扣[11]。上述方法都仅仅只是传统的粪链球菌培养方法和确证试验。此类试验缺乏一定的可操作性和准确性，易引起试验假阳性或者假阴性。随着现代科学技术的进一步发展，其确证试验，更倾向于快速准确的非培养检验方法。其技术也已由过去以表型方法为主转向结合基因型分析进行综合鉴定。王沛等[12]以临床标本中的粪肠球菌和屎肠球菌的快速鉴定为研究对象，建立了荧光原位杂交法，结果显示探针的特异性强，敏感性高。王亚宾等[13]利用超氧化物歧化酶(SodA)基因多态性涉及种特异性引物，建立了能同时测定猪源粪肠球菌和屎肠球菌的多重聚合酶链式反应(PCR)法，结果显示该方法具有快速、灵敏、准确和特异性强的特点。适用于基层实验室对肠球菌的诊断。林怡雯等[14]以大肠杆菌和粪肠球菌作为研究对象，建立了一种定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，结果显示该方法能够很好地应用于实际水样中活菌的选择性检测。周霞等[15]利用超声波裂解法制备粪肠球菌裂解物，通过棋盘滴定方法筛选最佳反应条件，建立了检测致羔羊脑炎粪肠球菌抗体的间接酶联免疫吸附(ELISA)检测方法，结果显示该方法重复性好、特异性强、准确性高、操作简便快速，适用于特异性检测粪肠球菌。黎满香等[16]通过比较肠球菌间编码核糖体亚基的基因(16S rDNA)的差异，建立了一种基于细菌16Sr DNA的粪肠球菌PCR检测方法，结果显示该方法能特异地检测粪肠球菌，且敏感、简易、快捷，适用于特异性检测粪肠球菌及实验室的日常检测。

　　　以上这些新技术的研究为羽绒羽毛粪链球菌检测提供了技术支持，并且在其他领域应用较为广泛，但要将上述现代微生物检测技术完全应用到服装检测中，还需进一步的研究。

　　5结束语

　　我国羽绒及其制品正处于国际市场竞争激烈阶段，吸收并加强羽绒羽毛微生物生产和检测技术，这有利于提高我国羽绒及其制品的产品质量，促进我国羽绒市场的稳定，推动我国羽绒行业的发展，同时还能扩大我国羽绒行业在国际羽绒市场的影响力。目前，我国关于羽绒羽毛粪链球菌的检测标准较多，检测方法不统一，使得检验结果的差异较大甚至引起假阴性结果，而标准中确证试验方法无具体的试验描述，缺乏可操作性。为进一步增强羽绒羽毛粪链球菌检测方法的敏感性和特异性，建议在完善其检测标准的基础上，引入荧光原位杂交法、PCR法、ELISA法等快速准确的非培养检验方法，有效推进羽绒羽毛粪链球菌检测工作的发展。

　　参考文献：

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　　[2] FZ/T 80001—2002水洗羽毛羽绒检验方法[S].

　　[3] GB/T 10288—2003羽绒羽毛检验方法[S].

　　[4] SN/T 0475—95出口商品中粪链球菌群检验方法[S].

　　[5] EN 1884—1998 Feather and Down - Test Methods - Determinationof Microbiological State Ratified European Text [S].

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　　[14]林怡雯，李丹，吴舒旭，等.基于RT-qPCR选择性检测水中活性病原菌[J].环境科学，2012(11)：4040-4045.

　　[15]周霞，王晓兰，剡根强，等.粪肠球菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用[J].中国兽医科学，2008(05)：417-421.

　　[16]黎满香，林荣高，薛立群，等.粪肠球菌PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学，2010(12)：1255-1258.

　　(作者单位：上海市纤维检验所）